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TRABAJOS PREMIADOS

Premio Nacional de Medicina "Juan Jacobo Muñoz Delgado" Efecto de la endotelina 1 sobre la producción de anticuerpos y la aterogénesis, luego de una dieta rica en colesterol durante 36 semanas en conejos

Introducción

Diversas publicaciones le han atribuido un potencial papel terapéutico a los antagonistas de la endotelina 1 (ET1) en la enfermedad cardiovascular. Su potencial aterogénico ha sido definido en forma extensa y se han descrito depósitos de ET 1 en aterosclerosis experimental y humana. No se conocen los efectos del bloqueo inmunológico de la ET1 en modelos de aterogénesis basados en una dieta rica en colesterol (DRC). Quisimos averiguar si la inducción de anticuerpos antiendotelina 1 mediante el esquema propuesto y descrito previamente disminuye la carga de placa aterosclerótica en la aorta de conejos alimentados con DRC durante 36 semanas.

Objetivos

Evaluar el impacto de la inducción de anticuerpos antiET1 sobre la carga de placa aterosclerótica en la aorta de conejos alimentados con una dieta rica en colesterol y comparar la capacidad inmunogénica de dos tipos de adyuvante.

Diseño

Realizamos un experimento animal ciego y aleatorizado para determinar el impacto de la inducción de anticuerpos antiET1 en la aterogénesis en conejos sometidos a DRC.

Materiales y métodos

Se administró durante 36 semanas DRC a un grupo de 14 conejos Nueva Zelanda distribuidos así:

A: 4 conejos que recibieron DRC únicamente.

B: 5 conejos que recibieron DRC, inmunización subcutánea con ET1, 20 mg en tres do-sis cada 15 días previa a la iniciación de la dieta con adyu-vante de Freund.

C: 5 conejos que recibieron DRC y la mis-ma inmunización subcutánea con ET1 y adyuvante Monta-nide ISA 16.

D: Control: 4 conejos con dieta normal sin inmunización.

A las 16 semanas se sacrificaron un número igual de co-nejos de cada grupo, incluyendo controles. A las 36 semanas se sacrificaron los conejos restantes. Se realizó la extracción de la aorta y se determinaron por histomorfometría las di-mensiones del vaso, la luz y la placa aterosclerótica, y se calcularon las relaciones de área de la placa con la luz y el vaso para normalizar la carga de placa con el tamaño de los vasos.

Se realizó Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de toda la aorta a los conejos sacrificados a las 36 semanas y fue leída en forma ciega por dos observadores.

Resultados

Se evidenció una diferencia estadísticamente significativa en cuanto a área de la placa (P< 0,03 a las 16 semanas y p< 0,001 a las 36 semanas), perímetro de la placa (p< 0,04 a las 16 semanas y p<0,001 a las 36 semanas), espesor de la placa (p< 0,02 a las 16 semanas y p<0,001 a las 36 sema-nas) y las relaciones calculadas (p< 0,04 a las 16 semanas y p< 0,001 a las 36 semanas), a favor del grupo tratado con anterioridad con ET1 subcutánea y adyuvante de Freund, en el cual se obtuvieron los títulos adecuados de anticuerpos antiET1 plasmática (1/12800).

Conclusiones

Los presentes resultados sugieren que la inmunización subcutánea con ET1 y adyuvante de Freund disminuyen en forma significativa la aterogénesis producida por una dieta rica en colesterol en conejos Nueva Zelanda, a las 16 y 36 semanas, como consecuencia de la inducción de niveles al-tos de anticuerpos plasmáticos AntiET1 sin producir efec-tos adversos clínicos. Estos hallazgos sugieren que la ET1 tiene un papel fisiopatológico en la generación y progresión de la placa aterosclerótica y puede ser un potencial blanco de terapias para disminuir la aterosclerosis y sus consecuencias.

Introducción

Diversas publicaciones le han atribuido un potencial papel terapéutico a los antagonistas de la endotelina 1 (ET1) en la enfermedad cardiovascular (1-5). Los efectos vasoconstrictores, actividad proliferativa y de migración de las células de músculo liso vascular que ejerce la ET1 sobre las paredes de los vasos sanguíneos, en arterias coronarias humanas y en la aorta de conejos y ratas han sido definidos en forma extensa.(6-18). Además, se han descrito depósitos de ET1 en aterosclerosis experimental y humana por diversos métodos y se han detectado niveles altos de ET1 o sus precursores en te-jidos o en plasma de individuos con enfermedad aterosclerótica o infarto agudo del miocardio (19-26). En pacientes con factores de riesgo para desarrollar enfermedad coronaria, tales como hiperlipidemia, diabetes, tabaquismo e HTA, sin evidencia de aterosclerosis establecida, se han encontrado niveles plasmáticos altos de ET1 y depósitos de la misma en las paredes vasculares y la reversión de dichos factores normaliza los niveles plasmáticos y tisulares de ET1.

Estudios in vitro han mostrado que los factores proaterogénicos, como la LDL oxidada, induce un aumento de la síntesis y liberación de ET-1 y la expresión del mRNA que codifica para la ET-1 está aumentado en lesiones ateroscleróticas (27 a 53). El papel de la ET1 en la génesis de la placa aterosclerótica no está bien establecido, pero hay multitud de estudios que sugieren que juega un papel fisiopatológico en la aterosclerosis (54 a 78) y en la restenosis coronaria postangioplastia (79-80). Se postula que la presencia de los factores de riesgo aterogénicos, crea un desequilibrio entre las sustancias relajantes, antitrombóticas y antiproliferativas del endotelio, como el óxido nítrico y las sustancias constrictoras, proliferativas y trombogénicas, como la ET1 y la angioten-sina. Al parecer, la presencia de LDL oxidado consume co-factores necesarios para la síntesis de óxido nítrico a partir de la L arginina, tales como NADPH, lo que establecería el desequilibrio mencionado.

El bloqueo de la ET1 podría restablecer dicho equilibrio y prevenir la formación o el crecimiento de la placa. Sin embargo, no se conocen los efectos del bloqueo inmunológico de la ET1 sobre las paredes vasculares en modelos de aterogénesis basados en DRC. Hemos descrito un esquema de inmunización subcutánea con ET1 para generar anticuerpos endógenos contra la misma (AntiET1) en conejos y en cerdos (79).

El proceso de formación de la placa aterosclerótica comienza con la presencia de factores de riesgo (81), como un aumento marcado de los niveles de colesterol sérico, especialmente la fracción LDL, (82-83 así como también la hipertensión arterial, el tabaquismo, la diabetes mellitus, entre otros. Dichos factores de riesgo constituyen causa de estrés oxidativo a nivel del endotelio arterial, (84 modificando las condiciones de oxidoreducción a ese nivel, con una disminución en la producción de óxido nítrico y disminución en la eliminación de los peroxinitritos, productos intermedios del catabolismo del óxido nítrico (NO), y que son potentes radicales libres.

Por otro lado, la síntesis del NO a partir de la Larginina por intermedio de la sintasa del NO se ve disminuida por la competencia que sobre los cofactores reducidos que la sintasa requiere (NADH y NADPH) ejerce el LDL oxidado. La consecuencia directa es un acumulo de radicales libres y colesterol LDL oxidado en las capas subendoteliales, con disminución en la actividad vasodilatadora, antiproliferativa y antiagregante plaquetaria del NO y predominio de las ac-ciones opuestas por parte de la angiotensina II, endotelinas, tromboxano, entre otras, por el desequilibrio emergente a esa escala. Hasta aquí podemos llamar la fase inicial del proceso aterosclerótico o disfunción endotelial.

Una vez que el LDL oxidado penetra las células endoteliales, genera una serie de reacciones moleculares e inflamatorias que tienen como consecuencia la aparición de la estría grasa, que constituye la segunda fase.(85-86) En ella, lo primero que ocurre es la liberación de integrinas y factores quimiotácticos que atraen leucocitos y macrófagos, los cuales fagocitan las moléculas de LDL oxidado y forman células espumosas que, a su vez, tienen la capacidad de atraer más células. También ocurre la liberación de moléculas de adhesión celular, como el ICAM y VCAM, que tienen actividad quimiotáctica y de atracción de leucocitos, especialmente linfocitos hacia el tejido afectado. La atracción local de los macrófagos va seguida de su activación, la cual se multiplica en forma sistémica, y puede producir reacciones inflamatoria a distancia en otros lechos vasculares arteriales y venosos por la actividad multiplicada de los macrófagos, mediada por la MCSF (Factor Estimulante de Colonias de Macrófagos), potente mitogénico y quimioatractante. De forma simultánea, se libera el factor tisular que aumenta la capacidad de adhesión de las plaquetas y macrófagos a través del estímulo del CD40 (87, 88) y factores de crecimiento que estimulan la multiplicación de las células de músculo liso vascular y la producción de matriz extracelular, lo cual forma una reacción de cuerpo extraño que envuelve a los macrófagos y el LDL oxidado, y forma la estría grasa. Dichos factores de crecimiento son liberados por leucocitos, macrófagos, plaquetas y células endoteliales. Sustancias como la insulina, la angiotensina II y la endotelina 1 tienen potente actividad proliferativa comprobada.

La placa aterosclerótica temprana (estría grasa) puede continuar creciendo. La velocidad de crecimiento depende de la acumulación de células y de colesterol, pero a mayor velocidad de crecimiento, menor posibilidad de formación de la cápsula fibrosa de la placa. Los linfocitos T producen estromielisinas y los macrófagos producen metaloproteinasas (89) que digieren la capa fibrosa y, por otro lado, dificultan la síntesis de matriz extracelular mediante la producción de interferón gamma. Los macrófagos tienden a acumularse en los sitios de mayor velocidad de crecimiento (hombros de la placa) y es por allí por donde puede romperse más fácil dicha placa. La posibilidad de ruptura no se relaciona con el porcentaje de obstrucción de la luz del vaso, sino con la velocidad de crecimiento. Una vez que la placa se rompe, se exponen al contacto con el torrente sanguíneo sustancias como el LDL, glucoproteínas subendoteliales Ib/Ia, proteoglicanos y otros, que estimulan la adhesión de las plaquetas, la activación de las mismas y, por último, la agregación plaquetaria mediada por la glicoproteina IIb/IIIa, que es el efector final y que permite formar un tapón plaquetario que puede adherirse al sitio de ruptura con una estabilidad variable, dependiendo de la profundidad de la ruptura y de la cantidad de plaquetas activadas. Si persiste el trombo plaquetario, se puede estimular la activación del factor X y VII y así, se iniciaría la cascada de la coagulación y la formación de un trombo estable de fibrina que puede ocluir en forma permanente la luz arterial.

Las sustancias vasoconstrictoras y proliferativas como la angiotensina y la endotelina pueden magnificar esta cascada, ya que se ha demostrado in vitro que activan el factor de necrosis tumoral, el factor nuclear kappa, las moléculas de adhesión como, el VCAM, la interleukina 6 y la proteína quinioatractante de monocitos 1 (MCP¨1), y aumentan la producción de proteína C reactiva. (90)

La endotelina (ET) fue descubierta en 1988 por Yanagisawa. Es el vasoconstrictor más potente que se conoce (10 veces más que la angiotensina II). Es un polipéptido de 21 aminoácidos similar a la safarotoxina, componente principal del veneno del áspid (ofidio que mató a Cleopatra). Tiene una vida media de 77 segundos en el plasma y está sujeta a una secreción autocrina continua. Dicha secreción se realiza en la célula endotelial, tanto luminalmente (fracción que está reflejada en la concentración plasmática) como abluminalmente, siendo esta última la secreción más importante y que no se ve reflejada en la concentración plasmática.

(91-94)

Se conocen cuatro isoformas de la ET, cada una codificada por un gen diferente, pero la más importante es la ET1, conocida como endotelina humano-porcina.

El precursor es la preproendotelina, péptido de 203 aminoácidos que es clivada a proendotlina (más conocida como big endothelin) de 92 aminoácidos por una endopeptidasa que es bloqueada por el péptido atrial natriurético (PAN). Posteriormente, por acción de la enzima convertidora de endotelina (ECE) se realiza la partición a la forma más activa de 21 aminoácidos. Todas tienen efectos hemodinámicos, aunque menores en los dos precursores. El gen de la preproendotelina es regulado por un RNA mensajero que es sensible a glucosa, interleukina 1, factores de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF) e insulina (IDGF), vasopresina, estrés de rozamiento catecolaminas, calcio, trombina, HDL, angiotensina II, nicotina, hipoxia, radicales libres, compresión vascular. A su vez, es inhibido por nitratos, anticálcicos, GMPc, AMPc, metaloproteasas, fosaramidón, pepstatinas.(95, 96) El mecanismo de acción de la ET1 se ejerce a través de los receptores, todos acoplados a la proteína G, la fosfolipasa C y la proteinkinasa C. Hay dos tipos de receptores. (93-106)

ETA: receptores para ET1 en el músculo liso, que al ser estimulados producen una contracción muscular potente y una proliferación celular.

ETB: receptores en las células endoteliales con afinidad por todas las endotelinas. Al ser estimulados producen vasodilatación inicial, liberación de NO y luego, vasoconstricción por producción de ET. Estimulan la agregación plaquetaria.

La unión de la ET al receptor estimula la activación de la proteína G, se activa la fosfolipasa C que libera inositol trifosfato, precursor del ATP, el cuál aumenta el calcio intracelular y favorece la fosforilación de la cadena liviana de miosina y la contracción celular con la subsiguiente vasoconstricción. Por otro lado, la fosfolipasa C libera diacilglicerol, el cuál activa la proteinkinasa C, que también aumenta el calcio intracelular mediante la activación de la ATPasa de Na-Ca. Las acciones conocidas de la ET1 son:

(90, 97, 107-118)

- Aumento del calcio intracelular, inotropismo positivo.
- Aumento de la presión arterial.
- Vasoconstricción directa.
- Disminución del umbral de fibrilación ventricular (arrit-mogénica).
- Mitogénesis y citotoxicidad. Aumenta la expresión de genes C-myc y C-fos.
- Facilita la apoptosis y remodelación vascular.
- Aumenta la secreción de moléculas de adherencia (VCAM).
- Estimula la infiltración de macrófagos.
- Aumenta la entrada de LDL oxidado a la célula endotelial (aterogénica).
- Aumenta la proliferación y migración del músculo liso.
- Aumenta la síntesis de elastina, colágeno y glucosaminoglicanos.
- Contracción del músculo liso bronquial, uterino, ileal.
- Aumenta in vitro la diapedesis de leucocitos y fibroblastos.
- Aumenta la frecuencia cardiaca.
- Activa la fracción c3, c5 del complemento.

Estos efectos son dosis dependiente y aunque la ETI actúa sobre las arterias, las venas y los vasos linfáticos, su efecto máximo es sobre las arterias coronarias subendocárdicas. Existe heterogenicidad en la distribución de los receptores para ETI en las coronarias, predominando los ETA en el músculo liso distal y en la coronaria derecha, y los ETB en de la capa media de la coronaria izquierda. (119-120-121 La concentración plasmática de la ET1 normal es de 1.8 más o menos 0.4 pmoles/lt. Existe extracción renal y principalmente pulmonar (107,109). Dicha concentración se duplica normalmente al sentarse o pararse y regresa a lo normal en cinco minutos, apareciendo otro pico menor a los 30 minutos. Este reflejo normal se pierde en la insuficiencia cardiaca, la insuficiencia renal crónica, y otras patologías que cursan con aumento de la concentración plasmática de ET1, como son:

(107,122)

- Toxicidad por ciclosporina - asma - accidente cerebro-vascular.
- Estrés - shock de cualquier origen.
- Hipertensión pulmonar - depresión endógena - colon irritable.
- Hipertensión arterial sistémica - ductus arterioso persistente.
- Vasoespasmo después de hemorragia subaracnoidea.
- Postangioplastia e implante de marcapasos .

La aterosclerosis es la patología crónica más prevalente en el mundo y con la aterotrombosis constituyen el mayor problema de salud pública del mundo desarrollado, siendo responsables de la enfermedad cardiocerebrovascular y sus secuelas. La modificación de los factores de riesgo ha disminuido en forma muy parcial la prevalencia de la enfermedad, pero a pesar de los enormes esfuerzos en educación, prevención primaria y secundaria, ésta continúa siendo la primera causa de mortalidad en adultos, (123) incluso en Colombia, donde ocupa el primer lugar como causa de mortalidad en mujeres mayores de 44 años, y el segundo lugar en la población general adulta. En hombres mayores de 45 años es la segunda causa de muerte en Colombia. Los costos de atención de la enfermedad coronaria son incalculables, y los días laborables perdidos son 1.400.000 por año en el país. Esto, además, ocasiona la pérdida de innumerables años de vida saludable, incapacidad laboral y costos incalculables para la sociedad. Los pacientes requieren seguimiento costoso. Ese control implica personal altamente entrenado, equipos sofisticados, suministros de alto costo, que han situado a la enfermedad coronaria dentro del grupo denominado "enfermedades catastróficas ". No existe en la actualidad un medicamento o procedimiento terapéutico alguno que se utilice en el tratamiento o prevención directos de la aterosclerosis. Dado que la aterosclerosis tiene un componente proliferativo comprobado y que la endotelina 1 ha demostrado que aumenta el crecimiento del tejido subendotelial, los resultados de este estudio podrían redundar en la demostración de un papel patogénico crucial de la endotelina 1 en el pro-ceso de formación de la aterosclerosis, y en el largo plazo, sentar las bases de una nueva estrategia de tratamiento y prevención.

Objetivos generales

- Reproducir y validar el esquema de inmunización con endotelina 1 subcutánea en conejos. - Reproducir y validar la técnica de titulación de anticuerpos antiET1 séricos por ELISA. - Continuar la línea de investigación en Endotelina 1 y su papel en la fisiopatología de la enfermedad cardiovascular.

Objetivos específicos

- Evaluar el impacto de la inducción de anticuerpos anti-ET1 sobre la carga de placa aterosclerótica en la aorta de conejos alimentados con una dieta rica en colesterol. - Comparar la capacidad de dos tipos diferentes de adyuvante para facilitar la producción de anticuerpos antiET1. - Validar nuevamente la técnica de histomorfometría para calcular la carga de placa aterosclerótica en aorta de conejos.

Hipótesis

La inducción de anticuerpos antiendotelina 1 mediante el esquema propuesto y descrito previamente disminuye la carga de placa aterosclerótica en la aorta de conejos alimentados con dieta rica en colesterol durante 36 semanas.

Diseño

Experimento animal, ciego, aleatorizado y controlado.

Materiales y métodos

Se administró durante 36 semanas una dieta rica en colesterol al dos por ciento (DRC), descrita por Abela y cols,(124) a un grupo de 14 conejos Nueva Zelanda distribuidos en 4 grupos:

A: conejos que recibieron DRC unicamente.

B: conejos que recibieron DRC, inmunización subcutánea con ET1 (20 mg en tres dosis cada 15 días previas a la iniciación de la dieta) y adyuvante de Freund.

C. conejos que recibieron DRC y la misma inmunización subcutánea con ET1 y ad-yuvante Montanide (ISA 16).

D: grupo control: conejos con dieta normal sin inmunización. Para la titulación de los An-tiET1 en plasma, se utilizaron dos conejos sin dieta rica en colesterol, inoculados con adyuvante (Freund o Montanide ISA 16) subcutáneo únicamente y no fueron sometidos a análisis de placa aterosclerótica, solamente participaron en la calibración y estandarización de la titulación de AntiET1 plamáticos como controles con adyuvante. En todos los grupos se titularon los niveles de AntiET1 basales y 14 días después de cada una de las inmunizaciones subcutáneas mediante la técnica de ELISA en espectrofotómetro (lector de ELISA Multiskan MCC/340) a 492nm.

Se midieron, además, los niveles de colesterol sérico basales a las 16 y 36 semanas de estar sometidos a la dieta en cada grupo mediante fotocolorimetría. A las 16 y 36 semanas se sacrificaron algunos conejos de cada grupo y se realizó la extracción de la aorta desde la válvula aórtica hasta la bifurcación de las iliacas. Se obtuvieron bloques de tejido de la aorta proximal, descendente y abdominal infrarenal, realizándose en forma ciega y al azar, cortes en cada segmento para el análisis al microscopio de luz, para detectar placa aterosclerótica. De cada segmento se obtuvo un mínimo de tres cortes. Los cortes fueron leídos en forma ciega al microscopio de luz y las dimensiones de los vasos fueron medidas en el programa Image ProPlus de Histomorfometría en el Laboratorio de Biología Vascular de la Fundación Cardioinfantil Instituto de Cardiología. Se midieron el área total del vaso, el área de la luz, el área de la placa, el perímetro de la luz, el perímetro de la pla-ca, el espesor máximo de la placa, y se calculó la relación del área de la placa, el área de la luz y el área de la placa y el área del vaso, el perímetro de la placa, el perímetro de la luz. A los conejos sacrificados a las 36 semanas se les realizó inmediatamente antes del sacrificio, resonancia magnética nuclear de toda la aorta, y las imágenes fueron leídas en forma ciega por dos observadores diferentes para definir la presencia o la ausencia de placa aterosclerótica. Los procedimientos se adhirieron a las normas vigentes en investigación en salud en Colombia, incluyendo el sacrificio de los animales (125) y el estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Investigación Animal de la Fundación Cardioinfantil - Instituto de Cardiología.

Análisis estadístico: los datos fueron ingresados a una base de datos en excel. Se realizó un análisis descriptivo de todas las variables medidas. A las variables categóricas de ti-po nominal se le calcularon las proporciones de ocurrencia, y a las variables numéricas se les calcularon medias, desviaciones estándar y medianas. Para establecer las diferencias entre los resultados de los grupos de estudio y el grupo control se utilizaron pruebas de estadística no paramétrica, como el test Wilcoxon y el test de MannWhitney. El nivel de significancia para las diferentes pruebas estadísticas se estableció en 0.05. Para el manejo de los datos y el análisis de la información se utilizó el paquete estadístico SPSS. La tabla 1 muestra la distribución de los grupos de conejos.

Se evidencia una diferencia estadísticamente significativa en cuanto al área de la placa, el perímetro de la placa y las relaciones calculadas, al comparar el grupo que recibió dieta rica en colesterol (DRC) o los grupos inmunizados, con el control negativo (sin DRC ni inmunización ), lo cual valida el modelo como aterogénico. La comparación entre el grupo de DRC o el grupo inmunizado con ET1 y adyuvante Montanide con el grupo inmunizado con ET1 y adyuvante de Freund (Tabla 4) muestra una diferencia estadísticamente significativa en la carga total de placa aterosclerótica a favor de este último grupo, el cual tuvo los títulos más significativos de anticuerpos plasmáticos AntiET1, luego de tres inmunizaciones subcutáneas con ET1. Dicha disminución se obtuvo a pesar de haber tenido ese grupo los niveles más altos de colesterol plasmático a las 16 semanas, y estas dife-rencias se acentúan a las 36 semanas (Tabla 5).

No hubo diferencias significativas entre el grupo de DRC y el grupo inmunizado con ET1 y adyuvante Montanide, en cuanto a las dimensiones medidas o calculadas de la placa. Tampoco se observan diferencias significativas entre los grupos en cuanto al área del vaso, el área de la luz, perímetro de la luz, (excepto al comparar el grupo control negativo y el grupo de DRC), indicativo de ausencia de efecto sobre la remodelación vascular. El esquema de inmunización utilizado nuevamente permitió obtener títulos adecuados de anticuerpos plamáticos, al utilizar adyuvante de Freund, y por el contrario, no se obtuvieron títulos adecuados de anticuerpos en el grupo inmunizado con ET1 subcutánea y adyuvante Montanide ISA 16 (Tabla 3), y en dicho grupo no se obtuvo una disminución significativa de la carga de placa en aorta. Los resultados obtenidos se mantuvieron y en cuanto a la placa, se acentuaron a las 36 semanas y se mantiene la diferencia estadísticamente significativa. Dichos resultados no dependieron del tamaño de los vasos o la luz, tal como lo demuestra la persistencia de la diferencia estadísticamente significativa a favor del grupo inmunizado con ET1 y adyuvante Freund al calcular las relaciones. Los efectos de la dieta rica en colesterol sobre la formación de placa aterosclerótica no se correlacionaron con los niveles de colesterol plasmático obtenido a las 16 ó 36 semanas. No se observaron efectos adversos de la inmunización subcutánea con ET1 en los especímenes con el esquema utilizado. Para finalizar, la lectura de la RNM fue concordante con la histomorfometría, ya que detecta como positivas las aortas con placas mayores de 0,4 mm2.

Discusión

Nuestros resultados sugieren que la inmunización con ET1 subcutánea en el esquema utilizado inhibe la aterogénesis en forma significativa a las 16 y 36 semanas sin causar efectos clínicos apreciables sobre los especimenes. El bloqueo de los receptores de endotelina o de la acción de la ET1 sobre los vasos sanguíneos se ha intentado en muchas ocasiones para el tratamiento o prevención de la hipertensión arterial, la insuficiencia cardiaca o la aterosclerosis, mediante el uso de sustancias por vía oral o parenteral, con resultados alentadores. Kowala y Cols (126) lograron prevenir el desarrollo de aterosclerosis en hamsters luego de someterlos a una dieta rica en colesterol mediante el uso de BMS 182874, un antagonista del receptor ETA, y encontraron una disminución del número de células espumosas provenientes de macrófagos. Babaei y Cols (127) encontraron disminución de la carga de placa aterosclerótica en ratones con deficiencia de receptor de LDL colesterol mediante el uso de LU224332, un antagonista mixto de los receptores de ET1 durante 8 semanas sin relación con los niveles plasmáticos de colesterol.

Concluyeron también que el efecto se debe a la disminución de la formación de células espumosas provenientes de los macrófagos. Por otro lado, Barton y cols (128) utilizando LU135252 por 30 semanas en ratones deficientes de APO E, demostraron un aumento en el óxido nítrico y disminución del 31 por ciento de la carga de placa aterosclerótica en la aorta, independiente del perfil lipídico o la presión arterial. En un modelo diferente de aterogénesis mediante denudación con balón en aorta de conejos, comparada con aterogénesis mediada por DRC, Tepe y cols (129) encontraron que el LU135252 fue efectivo en prevenir aterogénesis en los conejos alimentados con colesterol por 6 semanas, pero no en los conejos sometidos a denudación con balón. Sin embargo, no existen informes en la literatura acerca de la prevención de la aterosclerosis mediante el bloqueo inmunológico de la ET1 ni el impacto de dicho bloqueo a un tiempo mayor. Nuestros resultados sugieren que la inmunización con ET1 subcutánea en el esquema utilizado inhibe la aterogénesis en forma significativa a las 16 y 36 semanas sin causar efectos clínicos apreciables sobre los especimenes.

La acentuación de las diferencias a las 36 semanas puede ser debido a la progresión mayor de la placa en los conejos no intervenidos, que genera divergencia en las curvas de las dimensiones de la placa. Es posible que el uso de anticuerpos provea un efecto más duradero sobre la acción de la ET1, sin las consecuencias adversas descritas para otras sustancias. (130) La inducción de inmunidad activa mediante la inmunización subcutánea con un antígeno en conejos no puede ser aún extrapolada a otras especies; es necesario comprobar y reproducir estos resultados en cerdos o primates más parecidos inmunologicamente al ser humano, y con un tamaño de muestra más representativo.

Conclusiones

Los presentes resultados sugieren que la inmunización subcutánea con ET1 y adyuvante de Freund, a diferencia del adyuvante de Montanide, disminuyen en forma significativa la aterogénesis producida por una dieta de 36 semanas rica en colesterol en conejos Nueva Zelanda, como consecuencia de la inducción de niveles altos de anticuerpos plasmáticos AntiET1 sin producir efectos adversos evidentes clínicamente. Estos hallazgos sugieren que la ET1 juega un papel en la génesis y progresión de la placa y puede ser un blanco potencial de terapias para reducir la aterosclerosis y sus consecuencias.

Agradecimientos

Los autores agradecen en forma muy especial al doctor Jaime Ruiz S. del Departamento de Epidemiología de la Universidad del Rosario, por su invaluable colaboración en el análisis estadístico y sus constructivos comentarios y aportes al trabajo. Así mismo, al doctor Rodolfo Dennis, Jefe de Investigaciones de la Fundación Cardioinfantil - Instituto de Cardiología y Profesor de Epidemiología de la Universidad Javeriana, por la revisión crítica del trabajo. Por último, a la doctora Catherine Cifuentes, Bacterióloga de la Facultad de Ciencias Básicas de la Pontificia Universidad Javeriana por la titulación de los Anticuerpos antiET1 en suero.

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